使(shi)用簡化的Coral Cryo電子(zi)斷層掃描工作(zuo)流程確保成功

低溫(wen)電(dian)子斷層掃描（CryoET）是一種成像(xiang)技術，可(ke)以(yi)(yi)讓研究人員以(yi)(yi)亞納米分(fen)(fen)(fen)辨率觀察(cha)蛋白質和(he)其他(ta)大生物分(fen)(fen)(fen)子。了(le)解(jie)分(fen)(fen)(fen)子的形(xing)狀和(he)結構，包括口袋和(he)裂隙，可(ke)以(yi)(yi)幫助研究人員設計(ji)能夠像(xiang)拼(pin)圖一樣附著(zhu)于分(fen)(fen)(fen)子的藥(yao)物。低溫(wen)ET成像(xiang)也(ye)因此成為了(le)解(jie)和(he)治療疾病(bing)和(he)失調的重(zhong)要基礎。

了解徠卡顯(xian)微(wei)系統的(de)無(wu)縫冷凍(dong)電子(zi)斷層掃描流(liu)(liu)程Coral Cryo如何使用共聚焦超分(fen)辨率更精確地定位(wei)您的(de)意向結構。利用該工(gong)作流(liu)(liu)程，您可以可靠地快速部署實(shi)驗，實(shi)現更好的(de)可重(zhong)復性、靈活性，并提高最終結果的(de)準確性。

冷凍電子斷層掃描(CryoET)

使用了冷凍電子斷層掃(sao)描（Cryo TEM），將在(zai)細胞(bao)環境內觀察生(sheng)物分子的(de)(de)分辨率提(ti)升到了1nm，達到了qian suo wei you的(de)(de)精度。通過這種方式，可以僅通過其形狀來(lai)識別單個蛋白質(zhi)，而且無(wu)需(xu)任(ren)何標(biao)記，甚(shen)至可以區分不同的(de)(de)構象，幫助深入理解分子社會學。

CryoET成像(xiang)為理(li)解空間蛋(dan)白質結構(gou)和(he)相(xiang)互作用提供了(le)一種全新的方法，有助(zhu)于解讀細(xi)胞機制并應用這些見解。例如，它們可(ke)能(neng)有助(zhu)于開(kai)發多(duo)種疾(ji)病的治(zhi)療方法。

但是(shi)，亞納米分(fen)辨(bian)率(lv)(lv)的(de)成像(xiang)存在(zai)多種挑戰：它的(de)成本高(gao)昂(ang)，需要大(da)量的(de)培訓，涉及許多儀器操(cao)作，而且大(da)多數情況下，電子顯(xian)微鏡（EM）無法選(xuan)擇性地顯(xian)示目標結構。為確保高(gao)成功率(lv)(lv)，在(zai)工作流程(cheng)的(de)光鏡（LM）階段(duan)，需要以盡可能(neng)高(gao)的(de)分(fen)辨(bian)率(lv)(lv)識別和(he)定位(wei)EM成像(xiang)的(de)目標體積。

徠卡顯微系統的(de)無(wu)縫低溫電子斷層掃描工作流(liu)程(cheng)Coral使用(yong)共焦超分辨率進(jin)行精確定位。該(gai)工作流(liu)程(cheng)不僅減少了(le)樣(yang)本(ben)制備(bei)的(de)步驟，還提高了(le)樣(yang)本(ben)裝載(zai)和轉移(yi)的(de)成(cheng)功率，從而提高了(le)On-Grid Lamella/CryoET工作流(liu)程(cheng)的(de)效率。

目標坐標以開放格式提供給后續的FIB研磨和LM-EM關聯。因此，您可以實現更高的工作效率和更好的實驗可再現性。這可以幫助您加速設施中的方案部署，并提高最終結果的準確性。

精確的三維體積定位

STELLARIS 5低溫(wen)共聚(ju)焦顯(xian)微鏡(jing)，包(bao)括(kuo)低溫(wen)平(ping)臺(tai)和轉(zhuan)移(yi)梭，是Coral Cryo工(gong)作流程(cheng)中精(jing)確定位(wei)的核心部(bu)分。與(yu)寬視場儀器相比，共焦顯(xian)微鏡(jing)的Z分辨(bian)率更高，在設計上更適合三維(wei)定位(wei)。

通過在后續的(de)(de)高精(jing)度關聯中(zhong)應(ying)用超分辨(bian)率的(de)(de)數(shu)據，STELLARIS 5 Cryo作(zuo)為一個獨立的(de)(de)組件，性能優于使用集(ji)成光(guang)鏡進(jin)行(xing)定(ding)位的(de)(de)EM解決方案，同時也釋放(fang)了寶(bao)貴(gui)的(de)(de)EM儀器時間。

使用(yong)熒光(guang)珠在(zai)樣本上施加一個基準標記(ji)。通過確(que)定它(ta)們(men)在(zai)三維圖像(xiang)數據中的(de)(de)位置，可以顯著提(ti)高Z軸上的(de)(de)定位精度。此外(wai)，徠卡還開(kai)發了(le)一種基于插(cha)值的(de)(de)方(fang)法，能夠(gou)以比系統的(de)(de)實(shi)際(ji)光(guang)學(xue)分(fen)辨率更(geng)高的(de)(de)精度找到(dao)熒光(guang)珠中心（正在(zai)申請(qing)zhuan li）。

LAS X Coral Cryo：基于插值的(de)三維(wei)定位，使用X和Y方向的(de)Z-堆棧的(de)截面(mian)。標(biao)記可在所有相關(guan)窗口中交(jiao)互移動。

安全完成工作流程的各個階段

STELLARIS 5 Cryo可結合先進(jin)的CryoET定位(wei)軟件（LAS X Coral Cryo），還可以無縫集成和轉移(yi)到低溫FIB或VCT平臺。傳統的低溫電子斷層(ceng)掃描的工作流程包(bao)含多個復雜(za)的步驟，特別(bie)容易(yi)出(chu)錯(cuo)，并經常破壞后續重要的成像步驟。人工準備、處理(li)和轉移(yi)樣(yang)本(ben)的步驟不僅麻煩、繁瑣，還可能導致樣(yang)本(ben)污(wu)染或反(fan)玻璃化。

Coral Cryo的(de)(de)工(gong)作流程改變了這一點。通過(guo)簡化工(gong)作流程，可(ke)以實現(xian)更廣泛的(de)(de)CryoET應用。精(jing)簡的(de)(de)步(bu)驟、高靈活性(xing)和安全(quan)性(xing)，可(ke)確保(bao)樣(yang)本的(de)(de)活力(li)、質量檢查(cha)，實現(xian)精(jing)確和可(ke)靠(kao)的(de)(de)三維(wei)定位機制。

低溫平臺是一個更穩定的(de)封閉系(xi)統，更容(rong)易(yi)操作，且(qie)無需從平臺上取下冷卻插件(jian)。樣本轉移梭的(de)裝(zhuang)載過程(cheng)簡單，可(ke)將樣本損(sun)失的(de)風(feng)險降至zui di，并促進沿儀器平臺的(de)轉移。

STELLARIS 5 Cryo可結合先進的(de)冷凍電子斷(duan)層掃描定位軟件(jian) (LAS X Coral Cryo)，并(bing)與冷凍FIB或VCT階段的(de)各(ge)種無縫集成和(he)傳輸選(xuan)件(jian)結合使用。

 Clamydomonas TauSense比例(li)尺(chi)10µm

Coral Cryo - 工作原理

集成解決方案的優勢

如果沒有準確(que)的目標(biao)位置(zhi)，片狀目標(biao)區域的方(fang)(fang)法(fa)通(tong)常是一種耗(hao)時的迭(die)代方(fang)(fang)法(fa)。與集(ji)成 LM-EM版本相比，使用(yong)Coral Cryo工作流程和STELLARIS 5 Cryo共聚焦(jiao)顯(xian)微鏡(jing)可以通(tong)過共聚焦(jiao)技(ji)術提供更高(gao)的分辨(bian)率(lv)，更好(hao)的圖像質量(liang)和更高(gao)的Z分辨(bian)率(lv)。Coral Cryo為(wei)精確(que)檢測目標(biao)熒(ying)光(guang)提供了光(guang)譜靈活性，我們du te的TauSense技(ji)術

以消除不(bu)需要(yao)的(de)自發熒光，并(bing)對目標識別(bie)進(jin)行微調(diao)，在進(jin)入EM階段之前可(ke)以預先(xian)檢查。

用TauSense成像工(gong)具檢查硅(gui)藻。光(guang)譜(pu)-500-640 nm光(guang)譜(pu)帶的(de)(de)強度圖像。TauContrast-Look-up-table表示(shi)光(guang)子的(de)(de)平均(jun)(jun)到達時(shi)間；短的(de)(de)到達時(shi)間為(wei)藍色，長的(de)(de)到達時(shi)間由黃色過(guo)渡到紅色。顯示(shi)了不同的(de)(de)結構(gou)。TauSeparation-T光(guang)譜(pu)成分被(bei)分離，成分1顯示(shi)葉綠體的(de)(de)自發熒光(guang)，0.1 ns；成分2顯示(shi)純凈的(de)(de)LifeAct-GFP信(xin)號，平均(jun)(jun)到達時(shi)間2.7 ns。樣本由德國TU Dresden，B CUBE的(de)(de)Nicole Poulsen提供(gong)。

靈活性

Coral Cryo提供兩種(zhong)不同的(de)工作(zuo)流(liu)程解(jie)(jie)決方案，為(wei)低(di)溫(wen)(wen)FIB顯微(wei)鏡提供高靈活性。通過(guo)我們(men)靈活的(de)工作(zuo)流(liu)程，我們(men)的(de)低(di)溫(wen)(wen)傳輸系(xi)統EMVCT可(ke)以連接市場上所(suo)有的(de)低(di)溫(wen)(wen)FIB 解(jie)(jie)決方案，為(wei)您提供Coral Cryo工作(zuo)流(liu)程的(de)所(suo)有優勢。對于(yu)Thermo Scientific Aquilos的(de)用戶(hu)，我們(men)提供集成(cheng)解(jie)(jie)決方案，通過(guo)將我們(men)的(de)樣本盒(he)與(yu)Aquilo低(di)溫(wen)(wen)FIB 的(de)硬(ying)件整合，進一步減少工作(zuo)流(liu)程的(de)步驟。

精簡的(de)端到(dao)端Coral Cryo工作流程提(ti)供了明(ming)確的(de)步驟、模(mo)塊和(he)無縫的(de)硬件和(he)軟件接(jie)口。由于無縫的(de)硬件和(he)軟件接(jie)口，Coral Cryo可以快(kuai)速部署在您(nin)的(de)設施或實驗室。

熒光結構(gou)的三(san)維定位用于冷凍電(dian)子(zi)斷層(ceng)掃(sao)描

熒光結構的三維定位用(yong)于冷凍電子(zi)斷層掃描。薄片轉移到低溫(wen)TEM上。由德國Martinsried的Max-Planck生物化學研究所的Anna Bieber和Cristina Capitanio友情提供(gong)(gong)；Stem由Florian Wilfling提供(gong)(gong)。

通(tong)過超分辨率(lv)的低(di)溫(wen)共聚焦顯微鏡識(shi)別(bie)熒(ying)光結(jie)構(gou)。使用樣本周圍的珠(zhu)子作為相關標記(ji)，可(ke)以在低(di)溫(wen)FIB-SEM上識(shi)別(bie)目標結(jie)構(gou)，并(bing)從(cong)細胞(bao)體積(ji)(ji)中磨出(chu)含有目標結(jie)構(gou)的薄片(pian)。薄片(pian)被轉移到低(di)溫(wen)TEM上，記(ji)錄薄片(pian)的傾斜(xie)系(xi)列(lie)。從(cong)傾斜(xie)系(xi)列(lie)中可(ke)以計算出(chu)三維體積(ji)(ji)，其(qi)分辨率(lv)可(ke)達(da)亞納(na)米級，并(bing)為可(ke)視化和分析創建一個(ge)渲染圖(tu)。

· A - 共(gong)聚(ju)焦三維(wei)體積(ji)的(de)最大強(qiang)度投影。目標結構（表(biao)達Ede1-eGFP的(de)酵母細胞，參與凝(ning)集素(su)介導(dao)的(de)內(nei)吞作(zuo)用(yong)）由一個(ge)箭(jian)頭描述出來。

· B - FIB研磨(mo)后的(de)TEM中的(de)FIB片層，疊加Ede1-eGFP的(de)熒光(guang)。

· C - 片層體積斷層圖(tu)的示例性圖(tu)像。正方形(xing)表示圖(tu)像D的位置。

· D-斷層圖的細節，描繪了相分離(li)的內細胞蛋(dan)白(bai)沉積。

比例(li)尺：A - 內部網格方塊的寬度。90μm，條(tiao)寬：35 µm.B, C, D - 插入物的邊緣(yuan)長度為2微米。

LNG-non-LNGHeLa細(xi)胞標記色(se)：深藍(lan)色(se)-Hoechst，細(xi)胞核；綠(lv)色(se)-MitoTracker Green，線粒(li)體；紅色(se)-Bodipy，脂質滴。白(bai)色(se)-珠子，反(fan)射模式-網格(ge)條。細(xi)胞由德國海德堡歐洲分(fen)子生(sheng)物學實驗室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。